цы. Например, ацетил-СоА — карбоксилаза из Е. coli способна диссоциировать на три фрагмента: 1) биотинкарбоксилпереносящий белок (с мол. весом 22 000), содержащий связанный ковалентно биотин, 2) биотинкарбоксилазу (димер с мол. весом 100 000) и 3) транскарбоксил азу (также димер с мол. весом 90 000). Биотинкарбоксилаза необходима для катализа начального АТР-зависимого карбоксилирования биотина, связанного биотинкарбоксилпереносящим белком. Транскарбоксилаза содержит ацетил-СоА-связывающий центр и катализирует перенос карбоксильной группы от связанного карбоксибиотина к ацетил-СоА с образованием пирувата. По-видимому, важно, что биотин присоединен к белку

на конце гибкой «ножки» (длиной в 1,6 нм), которая позволяет биотину перемещаться от активного центра карбоксилазы к активному центру транскарбоксилазы.

Имеется ряд важных вопросов, касающихся как механизма синтеза карбокснбиотина, катализируемого субъединицей биотинкарбоксилазы, так и механизма транскарбоксилазной реакции. Тот факт, что 180 из меченого бикарбоната включается в Рь отщепляемый от АТР в первой реакции, свидетельствует об образовании в качестве промежуточного соединения карбонилфосфата

О О II II

но—с—о—р—о-ОН

КАРБОННЛФОСФАТ

в результате нуклеофильной атаки АТР ионом НСОз. Карбоксильная группа этого реакционноспособного ангидрида переносится затем на биотин путем атаки на положение N-1' биотина. Эта двухстадийная последовательность является по существу последовательностью типа S7C (табл. 7-2). Косвенным доводом в пользу промежуточного образования карбонилфосфата служит способность биотинкарбоксилазы ускорять перенос фосфогруппы карбамоилфосфата, аналога карбонилфосфата, на ADP:

о о о

II II

Д Р +ADP > H2N-C—О- + АТР (8-51

H2N О ОН

Карбамоилфосфат

Эта реакция аналогична обращению той стадии, на которой, согласно существующим представлениям, происходит, по-видимому, образование карбонилфосфата из АТР и бикарбоната.

Другая возможность заключается в том, что концевая фосфатная группа АТР переносится на биотин с образованием енолфосфата [стадия а в уравнении (8-6)], который реагирует с бикарбонатом (стадия б) аналогично тому, как это происходит в фосфоенолпируват-карбоксилазной реакции (уравнение 7-80):

Бикарбонат Q

но-^^оч

II Air AL»1' I j

HN NH Ч/ - 0=aaC- ^N^NH

О 1 г/ (.9

Связанный биотин

" АТР ADP 1 ° Ч|

PI

О

Q II

C—N NH 0<8"6>

HO

Карбоксибиотин

Расщепление еиолфосфата на стадии б путем атаки ионом НСОз создает высоконуклеофильный центр у N-Г. Одновременно мог бы образоваться промежуточный реакционноспособный карбоннлфосфат, способный к реакции с N-Г.

Карбоксильная группа карбоксибиотина, вероятно, переносится в конечные продукты в результате нуклеофильной атаки карбонильного углерода енолят-анионом:

СоА—S—С=^СН>

Гнолят анион ^_^Д^

из ацетил-СоА НО—C^N NH *

О

О

11

СоА —S —С-СН, —СООН *-Пиппшн (8-7) Малонил СоА

В карбоксилтрансферазной реакции (табл. 8-2) наблюдался перенос трития от 3-3Н-пирувата в пропионил-СоА. Исходя из этого, можно сделать предположение о возможности участия 2'-карбонильной группы биотина в качестве протонакцепторной группы при образовании переходного енолят-иона [7а].

Для протекания стадии транскарбоксилирования необходимо присутствие определенного, связанного с белком иона двухвалентного металла, обычно Мп2+. Это обстоятельство позволило исследовать геометрию связывания субстратов относительно Мп2+ релаксационными методами (ЭПР и ЯМР) [8—10]. Роль металла может состоять прежде всего в облегчении енолизации акцептора карбоксила. Однако в случае пиру-ваткарбоксилазы анализ влияния связанного Мп2+ на времена релаксации 13С в субстрате показал, что расстояние между карбонильным углеродом и Мп2+ составляет ~0,7 нм. Это слишком большое расстояние, чтобы можно было предположить образование прямой координационной связи между металлом и карбонильным кислородом. Другое довольно привлекательное объяснение состоит в допущении образования связи между металлом и карбонильной группой биотина, как показано в уравнении (8-7); результатом (который мог бы быть вызван и образованием водородной связи с протоном) будет улучшение свойств биотина как уходящей группы в реакции замещения [11].

Дополнение 8-В Биотин

НАОС

К 1901 г. было установлено, что для роста дрожжей необходимо какое-то еще неизвестное вещество, которое получило название биос. В конце концов было показано, что биос — это смесь пантотеновой кислоты, инозитола и третьего компонента, который назвали биотипом. К 30-м годам этот же витамин был распознан по двум другим эффектам: как фактор ускорения роста и дыхания у Rhizobium trffolii, обитающего в корневых клубеньках клевера, и как витамин Н. Этот витамин необходимо вводить в рацион крыс для предупреждения дерматита и паралича, которые развиваются при скармливании крысам больших количеств сырого яичного белка. Выделение чистого витамина было ге