боте [4], авторы которой выделили из автолизатов быстро растущих дрожжей содержащее биотин вещество биоцитин, e-N-биоти-нил-Ь-лизин:

Теперь мы знаем, что лизиновый остаток биоцитина первоначально находился в составе белковой цепи в активном центре биотинсодержа-щих ферментов. Таким образом, в своих функционирующих формах бициклическая система биотина прикреплена к белку с помощью гибкой «ножки».

Биотин служит переносчиком карбоксильных групп в ряде реакций ^-карбоксилирования типа 5.В (табл. 7-1). Первым указанием на существование этой функции явились данные о способности аспартата частично заменять биотин в стимулировании роста дрожжей Torula cremoris. Было известно, что аспартат образуется путем переамини-рования из щавелевоуксусной кислоты, которая в свою очередь могла образоваться путем ^-карбоксилирования пирувата. Последующие исследования показали, что биотин необходим в АТР-зависимой реакции между пируватом и бикарбонат-ионом:

О

I!

нсо3- + Н3С—С—СОО"

АТР ADP + Р,

У/ , .

Пируватпррооксилаза;

О II

"ООС—СН2—С—СОО" (8-2)

Другие биотинзависимые карбоксилазы действуют на ацетил-СоА, пропионил-СоА и (З-метилкротонил-СоА, используя НСОз для присоединения карбоксильной группы в положениях, указанных стрелками на приведенных структурных формулах:

О СНз О

II I II+Н3С—С—S—СоА -*Н2С С—S—СоА

Ацетил-СоА Пропионил-СоА

О

II

Н3С—СН=С—С—S—СоА

I

сн3

/З-W етилщютонил~СоА

Заметим, что, хотя карбоксилирование (3-метилкротонил-СоА, строго говоря, не является р-карбоксилированием (гл. 7, разд К,3), присутствие двойной связи С = С, сопряженной с карбонильной группой, делает двойную связь изоэлектронной р-карбоксилированию.

1. Механизм действия биотина

Может показаться удивительным, что для протекания реакций кар-боксилирования необходим кофермент. Однако если бы эти реакции не были сопряжены с расщеплением АТР, то равновесие было бы сильно смещено в сторону декарбоксилирования. В результате сопряжения с расщеплением АТР карбоксилирование может протекать самопроизвольно. Например, экспериментально определяемая кажущаяся константа равновесия К! для карбоксилирования пропионил-СоА до S-метилмалонил-СоА при рН 8,1 и 28 °С выражается следующим уравнением [5]:

[ADP] [Pt] [Метилмалоннл-СоА] ^ у (8 3)

"~ [АТР] [НСО^] [Пропионил-СоА] ~~ ' ^

И

AG'=—24 кДж/моль.

Роль биотина заключается в осуществлении сопряжения расщепления АТР с карбоксилированием. Это достигается двухстадийным процессом, в ходе которого образуется промежуточное соединение карбо-ксибиотин. Существует лишь один биотинсодержащий фермент, который не нуждается в АТР. Пропионовокислые бактерии содержат кар-боксилтрансферазу, которая обратимо переносит карбоксильную группу от метилмалонил-СоА на пируват с образованием щавелевоуксусной кислоты и пропионил-СоА. АТР в этой реакции не нужен, поскольку свободный НСОз не служит субстратом. Однако биотин и здесь играет роль переносчика карбоксильной группы. В табл. 8-2 приведены функции биотина в реакциях АТР-зависимого карбоксилирования и транскарбоксилирования.

Таблица 8-2

Зависимое от биотина р-карбоксилирование (реакция типа S5A)a

2

Карбопсилазы су

HCOjн—С—с—

АТГ ADP + Р, j О

*Кар6окси6иотин ^—^—• ООС — С—С —

Транскарбоксилаза

О IIоос—с— СН2—СОО

о

Н3С—СИ2 — С—SCoA СОО

I

с-н

' См табп 7 2

О

д * II , \ «?

НС—С=С—С—также может карбоксипироватъся в положении, отмеченном эвезоочкаи

1У0 i лава о

Структура биотина (дополнение 8-В) указывала на то, что бикарбонат может обратимо присоединяться к витамину в положение^ 2'. Однако оказалось, что это не так. Ключ к разгадке механизма действия биотина удалось найти Ф. Линену с сотрудниками [6] на основании изучения «модельной реакции». Они показали, что очищенная р-метилкротонил-СоА — карбоксилаза крысы катализирует карбокси-лирование свободного биотина бикарбонатом (Н14СОэ ) в присутствии АТР. В то время как карбоксилированный биотин очень лабилен, обработка его диазометаном приводит к более устойчивому диметило-вому эфиру, который является производным N-Г-карбоксибиотина:

ADP

Это означает, что карбоксилированной формой биотина является N-l'-карбоксибиотин. Расщепление АТР необходимо на начальной стадии для присоединения СО2 и НСОз к биотину. В биотин, ковалентно связанный в активных центрах ферментов, была успешно введена также радиоактивная метка из 14СС>2, а обработка ферментов диазометаном с последующим гидролизом трипсином и пепсином приводила к образованию продукта, идентифицированного как N-l'-карбоксибиоци-тин. Для завершения каталитического действия фермента необходимо только перенести карбоксильную группу от карбоксибиотина к кар-боксилируемому субстрату. Предложенный механизм действия биотина подтвержден в настоящее время данными по ферментативному переносу карбоксильной группы от химически синтезированного карбоксибиотина на специфические субстраты [7].

Биотинзависимые ферменты, по крайней мере в некоторых случаях, могут диссоциировать на отдельные субъедини