в 2НгО, дейтерий обнаруживается в MOлекуле фруктозо-6-фосфата в положении С-1. Этот результат согласуется с ендиольным механизмом:

О

Положение 1 ~^^С^

н—с—ОН

с

II

с

он

Глюкозо-6-фоссрат цис-?иЬиол

(7-53)

Установлено, что при обратной реакции скорость превращения ^-содержащего фруктозо-б-фосфата составляет всего лишь 45% скорости превращения ^-содержащего соединения. Таким образом, был обнаружен первичный дейтериевый изотопный эффект, ожидаемый для лимитирующего расщепления связи С—Н.

Удивительный результат был получен, когда фруктозо-6-фосфат, содержащий в положении 1 изотопы 2Н и НС, подвергался изомеризации в присутствии большого количества немеченого фруктозо-6-фосфата. Продукт реакции глюкозо-6-фосфат содержал не только 14С, но и 2Н, а распределение изотопОв свидетельствовало о том, что 2Н присоединяется (в положение С-2) путем прямого переноса из положения С-1 [130]. Это указывает на то, что на протяжении половины оборотов действия фермента 2Н, отщепившийся из положения С-1, присоединяется к той же самой молекуле в положение С-2. Этот внутримолекулярный перенос протона свидетельствует о наличии сшг-переноса, т. е. переноса, при котором протон отщепляется и присоединяется с одной и той же стороны молекулы1*. Наличие ??Ш-переноса в сочетании с известной конфигурацией глюкозы у С-2 свидетельствует о том, что промежуточное соединение является ^ыс-ендиолом и что присоединение протона либо к С-1, либо к С-2 ендиола происходит с re-стороны. В каждом исследованном случае другие кетол-изомеразы также используют ^uc-ендиол и в большинстве случаев присоединение происходит с ге-стороны. Однако ман-нозо-6-фосфат—изомераза катализирует присоединение к Si-стороне.

2. Перенос протонов, контролируемый диффузией

Прямой перенос протона между атомами С-1 и С-2 при действии изо-мераз Сахаров может показаться удивительным. Как может очень подвижный протон оставаться присоединенным к группе фермента в течение миллисекунд или более, а не переноситься к молекулам растворителя? Может ли это означать, что в присутствии фермента предпочтительно происходит перенос гидрид-иона или атома водорода, а не перенос протона? Если это так, то наблюдаемый обмен протона с

1} Однако этот аргумент следует принимать с некоторой осторожностью. Известны неферментативные реакции, в которых протон отщепляется и присоединяется с противоположных сторон молекулы, причем в процессе реакции ие происходит обмена с растворителем [132].

растворителем должен представлять собой второстепенную побочную реакцию. В то же время, может ли группа фермента, которая отрывает протон, быть изолирована от водного окружения и таким образом более прочно удерживать протон? В последние годы было показано, что ни одно из этих объяснений не является удовлетворительным. Наиболее вероятным переносчиком протона в активных центрах ферментов служит имидазольная группа. В настоящее время принято считать, что протон не может быть перенесен от имидазольной группы с константой скорости, существенно большей чем 103 с-1. То же самое справедливо для сопряженных кислот других умеренно сильных основных групп, таких, как фосфат-ион.

В пользу этого предположения имеется следующий аргумент [133]. Известно, что скорость переноса протона от Н30+ к имидазольной группе [обратная реакция (7-54)] контролируется диффузией, причем константа скорости реакции равна 1,5-1010 М^-с"1:

ImH+ + H20 -<—*- [1тН+--ОН2] 1т+Он?. (7-54>

t

Очень быстрая стадия, контролируемая диффузией

(k~ 1,5-Ю10 М-1-с-1)

Константа равновесия реакции (7-54), вычисленная на основании значения р/Са для имидазола, равного 7,0, составляет 10~7 М. Поскольку /Ceq является также отношением общих констант скорости прямой и обратной реакций, мы видим, что для прямой реакции &f = 10_7-l,5X X 1010= 1,5-103 с-1. Такое невысокое значение скорости реакции объясняется тем, что в промежуточно образующемся комплексе [в уравнении (7-54) показан в скобках] протон большую часть времени находится на имидазольной группе. В течение небольших промежутков времени он оказывается на координационно связанной молекуле воды, но-многократно успевает вернуться на имидазольную группу, прежде чем

имидазол и ОН з разойдутся. В связи с этим неблагоприятным равновесием внутри комплекса контролируемая диффузией скорость переноса протона от протонированного имидазола к воде значительно ниже скорости переноса протона в обратном направлении.

3. Раскрытие цикла, катализируемое изомеразами

Глюкозо-6-фосфат—изомераза катализирует вторую реакцию, а именно, раскрытие цикла а-аномера глюкозо-6-фосфата [половина реакции мутаротации (6-75)]. Нолтман предположил, что протонирован-ное основание ВН+ (возможно, е-аминогруппа боковой группы лизина) и другая основная группа В (возможно, имидазольная) участвуют в раскрытии цикла, как показано на рис. 7-9. В то же время можно предположить существование механизма, в котором раскрытие цикла и образование ц«с-ендиола происходят одновременно в результате реакции внутреннего замещени