казать предположение о закреплении в процессе эволюции единого механизма, сходного по основным признакам [112].

Характер рН-зависимости реакций, катализируемых фумаразой, свидетельствует об участии в активном центре как кислотной, так и основной групп (гл. 6, разд. Д,5). Однако эти данные еще не дают основания для выбора между анионным механизмом и механизмом, включающим образование карбоний-иона. Предположение о том, что расщепление связи С—Н не является лимитирующей стадией, сделано на основании следующего наблюдения: малат, содержащий 2Н в npo-R-поло-жении, дегидратируется с такой же скоростью, как и обычный малат. Если действует анионный механизм [уравнение (7-41)], то это может

in*

1ЧО

iлава /

означать, что 2Н из про-7?-положения избирательно меченного малата удаляется на быстрой стадии и что уход ОН--группы протекает гораздо медленнее. Если это так, то 2Н должен «отмываться» из L-малата быстрее, чем это могло бы происходить в том случае, когда имеет место превращение в фумарат с последующей регидратацией в малат. В действительности же наблюдается обратная картина: гидроксильная группа отщепляется быстро, а 2Н — более медленно. Эти результаты свительствуют о наличии механизма с участием карбоний-иона:

*Н н' -оос

1

4

соон

он

а

Н СОО"

н

он- -оос н

*н+

H СОО" г

I (7-45)оос н

Хотя первичный изотопный эффект при измерениях скорости реакции отсутствует, наблюдались отчетливо выраженные вторичные изотопные эффекты при замене атома водорода у С-2 или атома водорода в рго-S-положении у С-3 малата на 2Н или 3Н. Так, отношение fe(JH)/^(2H) составляет 1,09 для атомов водорода, находящихся как в pro-5-положе-нии, так и в положении С-3 [113]. По-видимому, эти наблюдения подтверждают, во-первых, наличие механизма с участием карбоний-иона, а во-вторых, тот факт, что стадия б в уравнении (7-45) является лимитирующей (см. также разд. В, 4,6). Сопоставление величины Vmax для реакции гидратации фумарата, фторфумарата и дифторфумарата (104, 410 и 86 мкмоль-мл_1-мин~1-мг-1 соответственно) также, вероятно, свидетельствует о реализации механизма с участием карбоний-иона (студенту следует попытаться интерпретировать эти данные, прежде чем обращаться к оригинальной работе) [114].

Недавно выяснилось, что протоны, способные переходить от субстрата к основным группам белка, не обязательно должны быстро обмениваться с растворителем (см. разд. И,2). Действительно, было показано, что протон, отщепляемый фумаразой от малата, удерживается ферментом на протяжении относительно длительного промежутка времени. Скорость обмена протона между малатом и растворителем ниже скорости обмена между связанным фумарат-ионом на поверхности фермента и другой молекулой субстрата, находящейся в среде [115]. Так, оказалось, что суммарная скорость обмена определяется скоростью отщепления продуктов от молекулы фермента и что мы до сих пор не знаем, предшествует ли удаление протона отщеплению ОН- или следует за ним. Однако имеется и третья возможность — протон и гидроксильная группа могут присоединяться одновременно по согласованному механизму [115].

б. Е нол аза

Дегидратация 2-фосфоглицерата, приводящая к образованию фосфо-енолпирувата, фосфорилированного производного енольной формы пи-ровиноградной кислоты, катализируется ферментом енолазой и является

ключевой реакцией метаболизма Сахаров:

о-®

Н2С=С—COO" + Н20 (7-46)

Фосфоеноллируеагп

Исходя из данных, полученных при изучении изотопного обмена для этого фермента, было сделано предположение, что протон быстро удаляется, образуя карбанионное промежуточное соединение, распад которого является лимитирующей стадией [116]. Этот фермент функционирует, только находясь в комплексе с ионом металла [117], обычно Mg2+ и Мп2+. Из данных по исследованию релаксации протонов воды, полученных методом ЯМР, следует, что ион Мп2+ образует координационные связи с двумя быстро обменивающимися молекулами воды в свободном ферменте [118]. При связывании субстрата одна из этих молекул воды может быть иммобилизована и участвовать в реакции присоединения. Фосфатная группа субстрата может выступать в роли общего основного катализатора, облегчая отрыв протона от молекулы воды

[118]:

в, Аконитаза

Другой фермент этой группы, аконитаза (аконитат-гидратаза), катализирует две реакции: а) дегидратацию цитрата с образованием ?{«с-аконитата и б) регидратацию, протекающую по другому механизму, с образованием изоцитрата:

—В:

Цитрат

н н

~оос

он

^Lcoo-соо-н

(7-47)

трео-т>5-изоцитрат

Обе реакции полностью стереоспецифичны. В первой реакции (стадия а) отщепляется pro-^-протон от С-4 (стереохимическая нумерация) цитрата, а на стадии б образуется rpeo-Ds-изоцитрат. Присоединение протона в обоих случаях происходит с ге-стороны.

Так же, как и в случае фумаразы, фермент удерживает отщепившийся протон в течение достаточно длительного промежутка времени (до 7-10-5 с), что позволяет молекуле ^мс-аконитата иногда диффундировать от поверхности фермента и (если имеется