Hna, показанная в уравнениях (7-3) и (7-6)^. Заметим, что карбоний-ион изображается как резонансный гибрид двух состояний, в одном из которых (оксоний-ион) имеется двойная связь между углеродом и кислородом. Можно себе представить, что такая структура с двойной связью образовалась из исходной структуры путем внутреннего замещения неподеленной парой электронов, принадлежащих кислороду, как это показано маленькими стрелками. Такой внутренний тип замещения можно рассматривать также как реакцию элиминирования. Следовательно, как это часто бывает при изучении ферментативных реакций, мы сталкиваемся с семантической проблемой. Является ли эта реакция элиминированием или только наполовину происшедшим замещением? В целях классификации метаболических реакций проще всего рассматривать процесс в целом как реакцию замещения.

В стабилизированном карбоний-ионе углеродные атомы цикла С-2, С-1 и С-5, а также атом кислорода находятся почти в копланарном положении. Такая конформация цикла называется полукреслом.

а. Лизоцим

Существует предположение, что механизм ферментативной реакции, включающий образование кабоний-иона, действует в случае лизоци-ма — фермента, основная роль которого состоит в атаке и расщеплении полисахаридных цепей пептидогликанового слоя клеточных стенок бактерий [10]. Лизоцим содержится в качестве защитного агента в слёзной жидкости, в других выделениях организма и в очень больших количествах в яичном белке. Лизоцим из яичного белка был первым ферментом, у которого методом дифракции рентгеновских лучей была определена полная трехмерная структура [11].

*> Эта терминология мало пригодна для ферментов, так как, хотя рассматриваемые реакции являются реакциями нуклеофильного замещения (SN), распад фермент-субстратных комплексов с образованием продукта представляет собой обычно процесс нулевого порядка и цифры 1 и 2 в символах SNI и SN2 обозначают порядок или молекул яркость реакции.

Оказалось, что топография шести колец N-ацетилглюкозамина или N-ацетилмурамовой кислоты в молекуле полисахаридного субстрата в точности соответствует впадине в молекуле лизоцима. При действии лизоцима связь между четвертым и пятым кольцами разрывается (рис. 2-9). В предполагаемом активном центре остаток глутаминовой кислоты (№ 35) находится в положении, точно соответствующем его роли донора протонов [т. е. ВН в уравнении (7-10)], тогда как остаток аспарагиновой кислоты (№ 52) лежит на противоположной стороне впадины. Как Glu-35, так и Asp-52 имеют аномально высокие значения рК& (микроскопические р/Са составляют ~5,3 и 4,6 соответственно)1) в полностью протонированном активном центре [12], что связано с гидрофобным окружением и наличием водородных связей с другими группами. Asp-52 обычно диссоциирует первым, и благодаря возникающему электростатическому взаимодействию Glu-35 остается протонированным вплоть до рН ~6. Расположенные рядом положительно заряженные основные группы влияют на величины рКа, и поведение фермента, следовательно, зависит от ионной силы среды [12]. Анион Asp-52 лежит близко (на расстоянии ~0,3 нм) к центру положительного заряда, ожидаемого в карбоннй-ионе [13], и, по-видимому, должен стабилизировать карбоний-ион [см. схему (7—10)].

Реакция, катализируемая лизоцимом, завершается стереоспецифи-ческим .присоединением гидроксильного иона к карбоний-иону. Продукт реакции сохраняет исходную реконфигурацию. Такая стереоопецифич-ность реакций ферментсодержащих карбоний-ионов не удивительна, поскольку фермент, вероятно, участвует в образовании и благоприятной ориентации атакующего гидроксильного иона 2К

Как показывает изучение моделей, чтобы шесть сахарных колец субстрата были прочно связаны ферментом, кольцо, содержащее тот атом углерода, у которого происходит замещение, должно быть выведено из своего нормального состояния, соответствующего конформации «кресла», и перейти в форму «полукресла», необходимую для реализации механизма с участием карбоний-иона [15, 16]. Таким образом, в результате связывания полисахаридной цепи субстрата на шести различных центрах фермента происходит искажение конформации определенного цикла и возникает новая конформация, подобная конформации переходного состояния. Это, возможно, и является наиболее характерным аспектом ферментативного катализа.

6. Кинетические изотопные эффекты

1) При иоииой силе ~0,2.

2) Механизм действия лизоцима четко описай в работе Дикерсоиа и Гейса [14].

Связь углерод—водород расщепляется легче, чем связь углерод — Дейтерий, и значительно легче, чем связь углерод — тритий. Таким образом, в тех случаях, когда предполагают, что стадия, лимитирующая Скорость процесса, связана с разрывом связи С—Н, целесообразно сравнивать скорости расщепления связей С—4-1 и С—2Н. В случае реакции, катализируемой лизоцимом, медленная стадия не связана с разрывом связи углерод — водород, однако наблюдается вторичный кинетический изотопный эффект [17]. Различия в массе изотопов 1Н и 2Н приводят к небольшим различиям в колебательной энергии молекул, Содержащих этих изотоп