еет более сложный вид, чем зависимости, представленные на рис. 6-13 и описываемые приведенными выше уравнениями. Однако не составляет труда записать рН-функции Михаэлиса, а также соответствующие уравнения, подобные уравнениям (6-86) — (6-89), и для фермента с любым числам ионогенных групп в формах Е и ES. Следует иметь в виду, что в том случае, .когда свободный субстрат содержит группы, диссоциирующие в том интервале рН, в котором изучается ферментативная активность, в числителе выражения (6-88) появится и рН-Функция для свободного субстрата. Если в изменение активности фермента при варьировании рН вносит вклад изменение конформации белковой молекулы, то возможно кооперативное присоединение или отл^ча более чем одного протона, что должно отразиться на рН-фунюции Михаэлиса. Иногда это может привести к появлению дополнительного члена, аналогичного (4-32). Характер рН-зависимости ферментативной активности был детально проанализирован Диксоном [56], который предложил строить графики зависимости lg Кшах (или логарифма удельной активности) и —lg Км от рН. Типичные кривые такого рода представлены на рис. 6-14. В области значений рН = р/(а± ~ 1,5 график зависимости lg Ктах от рН имеет криволинейную форму, однако за преденами этого интервала ветви кривой асимптотически приближаются* к прямым, наклон которых равен единице, если в процессе диссоциации участвует один протон, или больше единицы, если имеет место кооперативная диссоциация нескольких протонов. Точки (пересечения асимптот с отрезком .прямой, параллельной оси абсцисс (ом. рис. 6-14), соответствуют значениям рКа- (Следует, однако, отметить, что к более надежным результатам приводит описание всех экспериментальных точек единой, теоретической кривой.) Криволинейный участок проходит всегда ниже-(или выше) точек пересечения на величину, равную lg 2 = 0,30 (или меньшую, если диссоциация протонов происходит кооперативно).

Вогнутые участки кривых зависимости lg /См от рН дают значения рКа свободного фермента или свободного субстрата, а выпуклые — значения рКа комплекса ES. Подобный подход к анализу рН-зависимо-стей параметров ферментативной реакции широко применяется энзимо-логами, однако он часто приводит к некорректным результатам. Например, многие кривые такого рода имеют очень резкий перегиб, криволинейный участок у них занимает интервал рН<<3; при этом расстояние-по ординате между кривой и точкой пересечения асимптоты с горизонтальным участком гораздо меньше 0,30^. Это означает, что связывание протонов происходит кооперативно и кажущийся рД"а сходен в таком случае с константой К в уравнении (4-33). Читателю, желающему глубже разобраться в обсуждаемых вопросах, можно рекомендовать теоретическую работу [57], где рассматриваются значения рКа переходного-состояния. Интересный анализ кривых с необычно острым максимумом проведен в работах [57а,Ь].

Примером фермента, детально изученного с точки зрения влияния-рН на кинетические параметры, может служить фумараза — фермент, катализирующий обратимую гидратацию фумаровой кислоты до яблочной [схема (6-64)]. В своей ранней очень интересной работе Алберти и др. [58] показали, что колоколообразная рН-зависимость имеет место как для прямой, так и для обратной реакции. Используя уравнения (6-88) и (6-89), эти исследователи рассчитали кажущиеся значения р/Са для групп а и Ъ фермента в буферных растворах с ионной силой 0,01 (табл. 6-1). Важно отдавать себе отчет в том, что кинетика этой обратимой реакции описывается более сложными уравнениями, чем уравнения (6-87)—(6-89), и поэтому кажущиеся значения рКа могут не совпадать с истинными. Однако очень заманчиво было бы допустить, что два значения рК& для свободного фермента, равные 6,2 и 6,8, соответствуют идентичным группам, по-видимому, имидазольным, со значениями микроскопических рД"а, составляющими ~6,5. Свойства фу-маразы будут обсуждаться далее в гл. 7, разд. 3,6.

1) Удивительно, что для большей части кривых, приводимых Диксоном и Уэббом [56] для иллюстрации рН-профилей ферментативной активности, наблюдается такое же отклонение от теоретической зависимости Многие из полученных значений рКа могут быть некорректными из-за участия в процессе диссоциации нескольких протонов, что приводит к более резким рН-переходам, или в результате экспериментальных -ошибок (например, ошибок, связанных с влиянием буфера).

Мутаротация глюкозы у Е. coli катализируется специфической мута-ротазой [59], .имеющей число оборотов 104 с-1. Форма графика зависимости —lg/См от рН указывает на наличие в свободном ферменте двух ионогенных групп со значениями рКа 5,5 и 7,6, а из характера зависимости lg Kmax от рН следует, что в комплексе ES присутствует одна группа с р/Са = 4,75 [59]. Последняя может представлять собой каталитическую группу [группу В' в схеме (6-79)], возможно имидазол в форме сопряженного основания. Почему группа, имеющая в свободном ферменте рКа = 7,6, никак не проявляется в комплексе ES? Либо эта группа

не участвует в катализе, либо величина р/Са для нее так сильно сдви