3- 10ш-3710= 1,14-1014 с-1.

Благодаря синхронному перемещению электронов от ОН~-иона через цепочку (маленькие стрелки на схеме) во время одного колебания может произойти нейтрализация зарядов. Заметим, что положения атомов кислорода к концу процесса остаются прежними, в то время как протоны, вовлеченные в образование водородных связей, слегка перемещаются на схеме влево. Реакция подобного типа не только является свидетельством удивительной подвижности водородных ионов, но и может иметь прямое отношение к таутомерному катализу в ферментах. Так, Уонг [55] высказал предположение, что перенос протона вдоль жестко фиксированной цепочки водородных связей в комплексе ES является неотъемлемой частью ферментативного катализа. Легко представить, что аналогичный синхронный сдвиг протонов может иметь место в связан

ных ДРУГ с Другом карбоновой кислоте, имидазольиой и фосфатной? группах:

Н-тОч О-х-Н—^N^N^- Н-^О Ov-H+

С V=/ Рх (6-84)

В результате происходит перенос протона от одного конца цепи к другому [как и на схеме (6-83)], что обеспечивается легким протеканием реакций таутомеризации. Аналогичный процесс может идти и при участии боковых групп белка, объединяя две группы активного центра и способствуя таким образом согласованному кислотно-основному катализу, подобно тому, как это происходит на схеме (6-79).

В белках возможны и другие процессы таутомеризации (при наличии менее стабильных «минорных таутомеров»). Так, например, может иметь место сдвиг следующего типа с участием пептидных связей в а-спирали или ^-структуре:

Н

, =дл--н-гЫ/ Н

(6-85)

\

H^N им7 \

HN н

Как показано на схеме, электроны перемещаются к гуанидиновой группе боковой цепи аргинина. Можно рассмотреть и другие варианты (и таких вариантов множество, особенно если учесть, что в реакции могут принимать также участие коферменты или пуриновые и пиримидиновые основания). Все подобные процессы протекают исключительно быстро* и с трудом регистрируются.

з. Влияние рН на активность ферментов

Изложенные выше данные об участии кислотных и основных групт в ферментативном катализе получены в основном в результате исследований неферментативных модельных реакций. Имеются ли какие-либо указания на то, что ферменты действительно содержат подобные группы? Да, имеются, и наиболее четкое из них — зависимость ферментативной активности от рН. Довольно часто кривая зависимости Vmax от РН имеет колоколообразную форму (рис. 6-13). Оптимальное значение ?'max наблюдается при значении рН, часто лежащем в интервале от 6* До 9, Кривые колоколообразной формы проще всего объяснить, допустив, что в активном центре фермента имеются две ионогенные груп-Ны — а и Ъ. В этом случае фермент может находиться в трех формах, Различающихся по степени протонирования, — Е, ЕН, ЕН2:

Е ES

ЬЕ

6ES

^2

*aEsf

т

ЕНа

ЕН<—» EHS

EH2S

ЕН + Продукты,

(6-86Ь

Обозначим константы диссоциации для двух групп в ферменте через КаЕ и КЬЕ, а соответствующие значения для комплекса ES — через KGES и Константы скорости &ь k% и &3 характеризуют стадии образования и распада комплекса ES.

Если допустить, что единственной реакционноспособной формой фермента, распадающейся с образованием продуктов, является форма EHS,

4 5 6 7 8 9 Ю

рН

РИС. 6-13 Теоретические зависимости Vm3X от рН, рассчитанные исходя из уравнения (6-87) при jfe3[E]t=l, p/CcEs = 6 и следующих значениях pKb^s: 1 — 1, // — 8 и ///—10 [58] Построенные при помощи ЭВМ графики любезно предоставлены К. Харрисом

(С. Harris).

то зависимости максимальной скорости от рН будут иметь колоколооб-разную форму (рис. 6-13). Подобные кривые часто встречаются в ферментативной кинетике, что подтверждает адекватность схемы (6-86). Кроме того, -если для протекания реакции группа а фермента должна быть диссоциирована до сопряженного основания, а группа Ь должна находиться в протонированном состоянии, то естественно допустить, что эти две группы участвуют в кислотно-основном катализе.

Для простого случая, описываемого схемой (6-86), рН-зависимости максимальной скорости и константы Михаэлиса описываются соответственно следующими выражениями:

1 ' KaES + [Н+]

К —JVbM V + КаЕ + [H+I J ,fi т

i1+ KaES + [НЧ j

Когда фермент полностью насыщен субстратом, присутствуют только формы EH2S, EHS и ES. Из определения KOES и K&ES следует, что при этом выполняется соотношение

lEl,= [EHS](l+-jЈL+-j^). (6-89)

В скобках стоит та же величина, что и в знаменателе выражений (6-87) и (6-88); иногда ее называют рН-фуикцией Михаэлиса {56]. Аналогичная по виду рН-футнкция для свободного фермента стоит в чисРИС. 6-14. А Зависимость Угаах от рН для кристаллической бактериальной а-амилазы [56а]. Б. Теоретическая зависимость lg/См от рН, рассчитанная исходя из уравнения <6-88) при рКаЕ=5, р/С&Е=Ю, p/CaEs-б и pK№s = 7. Построенный при помощи dbM

график любезно предоставлен К. Харрисом.

лителе выражения (6-88). рН-зависимость ферментативной активности часто им