ьсной лампы, быстро поглощается образцом, находящимся в параллельно расположенной трубке. Длительность импульса может меняться от Ю-12 до Ю-14 с. Сопровождающие вспышку изменения спектра поглощения или флуоресценции образца регистрируются при помощи фотоумножителя и осциллографа. В настоящее время в качестве источников света ?применяются лазеры, испускающие импульс света исключительно высокой интенсивности в течение нескольких наносекунд. Лазерная техника позволяет измерять весьма малые времена релаксации [31].

г. Некоторые результаты

Описанные выше методы позволили установить, что процессы образования комплексов между ферментами и субстратами протекают исключительно быстро [32] —значения константы k\ в схеме (6-14) часто лежат в интервале от 106 до 108 М-1-с-1. Тем не менее константа скорости второго порядка для взаимодействия фермента с субстратом ниже предельной величины, соответствующей бимолекулярной реакции, скорость которой лимитируется диффузией (109—1010 М^-с-1). Это означает, что молекуле субстрата требуется определенное время на то, чтобы должным образом ориентироваться и связаться с активным центром •фермента. Времена релаксации для переходов спираль — клубок в полипептидах составляют около 10~8 с, для ренатурации же предварительно денатурированных белков они могут (быть намного выше. Конфирмационные превращения производных циклогексана типа «кресло» — «лодка» при комнатной температуре происходят с характерным временем т, равным приблизительно 10~5 с, а вращение вокруг амидной С—N-свя-зи — с т«0,1 с, т. е. гораздо медленнее. Для неферментативной гидратации альдегидной группы пиридоюсаль-б'-фосфата (гл. 8, разд. Г) т со

ставляет от 0,01 до 0,1 с (ib зависимости от рН). Этот результат был щолучен с помощью метода температурного скачка [33], отличающегося своей надежностью.

Б. Ингибирование и активация ферментов

Активность большинства ферментов подавляется множеством соединений. Этот процесс часто отличается высокой специфичностью, и изучение связи между структурой ингибитора и его иигибирующей способностью оказалось весьма плодотворным для выяснения природы активных .центров и выявления комплементариости поверхностей биологических молекул. Ингибирование ферментов лежит также в основе действия большинства лекарств.

Ингибирование бывает обратимым и необратимым. Последнее относится к реакциям, приводящим к безвозвратной потере активности фермента [33а]. Примером необратимого иигибироваиия может служить инактивация фермента ацетилхолинэстеразы под влиянием ядов нервно-паралитического действия — фосфороргаиических соединений (гл. 7, разд. Г, 1). Часто стадии необратимой инактивации предшествует обратимое связывание ингибитора с комплементарным ему центром иа поверхности молекулы фермента. Здесь мы ие будем рассматривать математическую обработку кинетических данных, соответствующих необратимому иигибированию, и ограничимся обсуждением количествен^ лых аспектов действия обратимых ингибиторов.

1. Конкурентные ингибиторы

Ингибиторы, структурно аналогичные субстрату, способны связываться с субстрат-связывающим центром. В случае истинного конкурентного ингибироваиия должна иметь место конкуренция между субстратом и ингибитором за связывание с одним и тем же центром, а кроме того, связывание одного из этих лигандов должно исключать связывание другого. Сродство ингибитора к ферменту количественно выражается константой ингибироваиия Ки которая представляет собой константу «диссоциации комплекса фермента с ингибитором EI:

*'=-Т11Г- (6'43)

Если использовать допущение о стационарности и учесть в уравнении материального баланса для фермента ие только свободный фермент и комплекс ES, но и комплекс EI, то нетрудно убедиться в том, что в случае конкурентного ингибироваиия зависимость скорости от концентрации субстрата аналогична по виду уравнению (6-15). Однако коистаита должна быть заменена иа кажущуюся константу Михаэлиса (/См)» .зависящую от концентрации ингибитора:

Линейные анаморфозы уравнения скорости имеют следующий вид:

v Vma* v ^_45j

и

Чтобы выявить наличие конкурентного ингибирования, обычно строят графики зависимости v/[S] от v, описываемые уравнением (6-45), или l/v от 1/[S] [уравнение (6-46)] для реакций, протекающих в отсутствие ингибитора и в его присутствии при одной или нескольких фиксированных концентрациях. При наличии конкурентного иигибиро-вания получают семейство пря* мых, пересекающихся с одной и» ОСеЙ В ТОЧКе 1/УЩАХ (рис. 6-6). Иначе говоря, максимальная1 скорость не изменяется в присутствии конкурентного ингибитора. Если взять достаточно высокую концентрацию субстрата,, то всегда можно насытить фермент субстратом и полностью^ исключить связывание ингибитора. Из изменения наклона с ростом концентрации ингибитора нетрудно при помощи уравнений? (6-45) или (6-46) рассчитать величину К\.

При фиксированной концентрации конкурентного ингибитора график зависимости v от lg[S] (рис 6-7) просто смещается вправо вдоль оси абсцисс (т. е. в сторону больших значений [S