омп-лексе нейтрализовать ее. Это в свою очередь приводило бы к снижению -рК ЫНз-группы субстрата, способствуя отщеплению от нее протона [55]. Заманчиво полагать, что этот протон может быть затем

Ht ясно, почему полосы поглощения PLP в ферментах практически всегда обладают положительными КД- КД, по-видимому, индуцируется в симметричном хромофоре (в поглощающей свет группе) под действием электронно-асимметричного окружения белка. [Исключение составляют описанные в следующем разделе длинноволновые полосы поглощения хиноидных форм субстрат-коферментных имииов: с ними, как (Правило, связан интенсивный отрицательный экстремум КД. — Прим, ред.] перенесен (возможно, с помощью какой-либо группы белка) на азот С = г4-группы внутреннего шиффова основания [55]. Таким образом, нуклеофильная —гШг-группа связывалась бы в результате процесса, одновременно повышающего электрофнльные свойства углеродного атома иминной группы. Это делало бы возможным прямое присоединение ЫНг-группы к —C=N+H с образованием аддукта, изображенного в уравнении (8-28).

Как указали Иванов н Карпейский [55], каждая стадия в общей последовательности, по-видимому, изменяет электронные или стериче-ские характеристики комплекса в целом, так что следующая стадия облегчается. Эта концепция, хотя она не доказана, возможно, является важным принципом, общим для всей энзимологии: фермент будет эффективным катализатором, если каждая стадия будет приводить к изменениям, обеспечивающим благоприятные условия для следующей стадии.

Для многих стадий катализа PLP-зависимыми ферментами необходим перенос протонов, и каждый такой перенос влияет на следующую стадию реакций. Определенные стадии требуют изменений в конформации как субстрата, так и кофермента и ферментного белка. Например, для превращения аддукта в уравнении (8-28) в субстрат-коферментное шиффово основание необходима пространственная перестройка, которая может быть обусловлена поворотом вокруг одинарной связи, как показано в уравнении (8-28), или поворотом кофермен-та [33, 35]. Заметим, что элиминируемая г-амнногруппа [уравнение (8-28)] является сильно основной. Часто полагают, что эта основная группа участвует на следующей стадии в отщеплении а-Н и его переносе на 4'-углерод.

PLP можно удалить из аспартатаминотрансферазы, а вместо него вводить различные аналоги кофермента. Некоторые из аналогов хорошо связываются, но образующиеся комплексы обладают низкой каталитической активностью. Например, комплекс с N-метилированным PLP вообще не «вступает в оборот», когда добавлен глутамат. Этот факт, по-видимому, указывает на то, что протон при N-атоме пиридина должен удаляться на определенной стадии в цикле реакции, составляющей обязательное звено в программе ферментативного акта.

Читателю следует продумать, какие стерические затруднения могут встретиться в последовательности реакций и какова вероятность образования в реакции (8-28) аддукта с 5-конфигурацией вместо R-кок-фигурации.

Е. Кетокислоты и другие необычные электрофнльные центры

Некоторые ферменты, которые, казалось бы, должны были иметь в активных центрах пиридоксальфосфат, вместо него содержат связанные а-кетокислоты. Эти и некоторые, видимо родственные, ферменты с необычной функцией мы рассмотрим в данном разделе.

1. Декарбоксилазы

У некоторых биологических видов декарбоксилазы гистидина [56] и S-аденозилметионнна [57] содержат в активном центре ковалентно связанную кетокислоту. Эти ферменты ингибируются карбонильными реагентами и боргидридом. Если для восстановления гистидиндекар

к.о<рерменты — природные специализированные реагенты 23*

боксилазы Lactobacillus использовался 3Н-содержащий боргидрид, то» происходило включение 3Н, который после гидролиза обнаруживался в составе молочной кислоты. Это указывает на наличие остатка пиро-виноградной кислоты, присоединенного посредством амидной связи и претерпевающего следующие реакции:

СН3 Н3С

I | Пирувоильная С=0 3Н—С—ОН Фермент-NH2

группа | NaBH4 I НгО /

с=о > с=о — / „ >

I I Кислотный

HN HN гидролиз

I I

Фермент Фермент

Пируват, присоединенный

к ферменту через амидную

группу

з

СН

3Н~ С—ОН (8-29)

СООН Молочная кислота

Восстановление боргидридом в присутствии гистидина приводит к образованию ковалентной связи между этим субстратом и связанным пи-руватом. Таким образом, так же как и у PLP-содержащих декарбокси-лаз, образуется шиффово основание с субстратом. При декарбоксили-ровании, по-видимому, используется способность карбонильной группы амида акцептировать электроны [уравнение (8-30)].

СН3 СОО"

1гМГ5-сн'т=1 №-30)

Фермент —N—С " N NH

н 1° ~

Связанный Гистидин, связанный

пируват в форме шиффова основания

Когда микроорганизмы, продуцирующие гистидиндекарбоксилазу,. выращивали на среде, содержащей меченный 14С серии, то ,4С включался в связанную пирувоильную группу. Таким образом, серии является предшественником связанного пирувата. Фермент выраб