г-понг. Ясно, что из данных стационарной кинетики можно определить только часть этих констант; для оценки всех их необходимо использовать другие подходы.

Интересной особенностью механизма типа пинг-понг является то, что семейство прямых в двойных обратных координатах, которое получают при варьировании концентрации одного субстрата и фиксированных

1} Отметим, что если в уравнении (6-356) член КечКпв пренебрежимо мал по сравнению с другими членами, то по своим кинетическим свойствам реакция напоминает реакции, подчиняющиеся механизму типа пинг-понг, хотя протекает согласно последовательному механизму через образование промежуточного тройного комплекса ЕАВ.

^концентрациях второго, имеет другой вид, нежели семейство прямых «на рис. 6-5, Л: оно представлено прямыми, параллельными друг другу (как это выглядит на рис. 6-8 для неконкурентного ингибирования).

б. Непродуктивные комплексы

Характерной особенностью ферментативной реакции, протекающей ?що механизму типа пинг-понг, является то, что в стационарном состоянии часть фермента находится в форме Е, а часть — в форме Е'. В идеальном случае форма Е обладает сродством только к А и Q, а форма "Е' — только к В и Р. Однако во многих реальных ситуациях Р и В проявляют некоторое сродство и к форме Е (а А и Q — к форме Е'). Это легко понять, поскольку продукты и субстраты часто имеют сходную структуру. Таким образом, разумно предположить, что все четыре ^реагента будут обладать определенным сродством как к форме Е, так и к форме Е'. Иногда способность ферментов, чья кинетика следует механизму типа пинг-понг, образовывать непродуктивные (так называемые абортивные) комплексы, имеет регуляторное значение. Изменим схему (6-37) таким образом, чтобы показать, что продукт Р обычно претерпевает ряд дальнейших превращений:

Р

I > <

Дальнейшие превращения

ПепроЪдктивяый

комплекс _ г,

v. Q о

Щели продукт Р накапливается в достаточно больших количествах, он ™ожет взаимодействовать с формой Е с образованием непродуктивного •комплекса ЕР. Это явление представляет собой эффективную форму инги--бирования продуктом, которое снимается лишь в том случае, когда в результате дальнейших превращений продукта Р его концентрация уменьшается. В литературе описаны конкретные примеры подобного типа "ингибирования и рассмотрена его роль в регуляции процессов метаболизма.

в. Вывод уравнения скорости для сложных механизмов

Для простых кинетических механизмов типа рассмотренных выше «ывести уравнение стационарной скорости не составляет особого труда; иное дело — более сложные механизмы. Для решения задач стационарной и нестационарной кинетики применяется топологическая теория графов, широко используемая при анализе электрических цепей [23—25]. ^Рассмотрим диаграмму вида

Здесь представлена реакция, в которой связывание ферментом двух субстратов (А и В) происходит неупорядоченно [схема (6-34) соответствует, напротив, случаю упорядоченного связывания субстратов]. Образующийся комплекс ЕАВ распадается на свободный фермент и единственный продукт Р. Каждая из вершин графа (6-40), пронумерованных цифрами от 1 до 4, соответствует определенной форме фермента, а каждой стрелке приписывается определенная константа скорости первого порядка или кажущаяся константа скорости первого порядка. Следуя известным правилам, можно без труда вывести уравнение стационарной скорости [1].

Преимущества использования упрощенных схематических методов становятся особенно очевидными, если рассмотреть более сложный механизм, в котором комплекс ЕАВ распадается с неупорядоченным высвобождением двух продуктов (Р и Q). Знаменатель уравнения скорости для этого механизма содержит 672 члена, и ясно, что без введения ряда упрощающих предположений получить уравнение скорости чрезвычайно трудно. В подобных сложных случаях целесообразно прибегать к помощи ЭВМ [26].

г. Допущение о быстро устанавливающемся равновесии

Уравнения скорости часто упрощаются, если одна стадия в механизме [например, стадия каталитического распада комплекса ЕАВ в схеме (6-40)] является стадией, лимитирующей скорость ферментативного процесса. В предположении, что все стадии реакции, предшествующие лимитирующей или следующие за ней, равновесны, уравнение скорости для механизма с неупорядоченным присоединением двух субстратов и неупорядоченным отщеплением двух продуктов упрощается до уравне~ ния, аналогичного уравнению скорости в случае механизма с упорядоченным связыванием субстратов [уравнение (6-35а)]. Такое предположение действительно часто оказывается справедливым, однако в некоторых случаях (особенно для ферментов с высокой каталитической активностью) оно все же не выполняется.

д. Кинетика реакции при высоких концентрациях фермента

В опытах по изучению кинетических свойств очищенных ферментов в лабораторных условиях концентрации фермента составляют обычно Ю~7—10~10 М, в то время как в клетке они равны 10~6—Ю-5 М и, следовательно, могут быть гораздо выше концентрации соответствующих субстратов. В связи с этим при интерпре