еханизму переноса протона. Этот фермент, выделенный из Pseudomonas putida, катализирует реакцию эпимеризации [14], для осуществления которой не требуется присутствие кофактора.

СОГ СОI I

н—с-он -<—> НО-С—н

I I

с6н5 с6н5

В ходе этой реакции возможен дейтериевый обмен с растворителем, однако он идет с довольно низкой скоростью. При использовании в качестве субстрата о-манделата и проведении реакции в среде тритированного растворителя меченые D- и L-продукты образуются в эквимолярных количествах, что указывает на существование симметричного промежуточного соединения. Эти данные свидетельствуют об образовании промежуточного а-карбаниона, причем в роли акцептора протона выступает ферментативное основание. Лимитирующей стадией является перенос протона, поскольку первичный дейтериевый изотопный эффект достигает 5. Внутри фермент-субстратного комплекса эпимеризация идет с константой скорости порядка 103 с-1, что соответствует верхнему пределу скорости ферментативного переноса протона.

6.8. Ферментативный перенос протона: лизоцим

Лизоцим катализирует гидролиз (3(1—Н)-гликозидных связей мукополисахаридов, входящих в состав клеточных стенок некоторых микроорганизмов [ 15]. Помимо этого природного субстрата, который состоит из N-ацетилмураминовой кислоты и!М-аце-тилглюкозамина, лизоцим катализирует также гидролиз хитина (поли-Ы-ацетил-р-глюкозамина) и продуктов его разложения, а также некоторых (З-арилди-М-хитобиозидов. Подробно изучена трехмерная структура лизоцима: он представляет собой глобулярный белок, по форме отдаленно напоминающий бабочку, Одно «крыло» которой содержит значительное количество спиральных фрагментов, а другое состоит в основном из складчатых (3-структур. Активный центр расположен между «крыльями» и организован в виде щели, или впадины, способной вмещать длинноцепочечную полимерную молекулу природного субстрата.

Каталитический процесс в активном центре осуществляется, по-видимому, с участием карбоксильных групп аспарагиновой кислоты Asp-52 и глутаминовой кислоты Glu-35. Механизм действия лизоцима — фермента с наиболее изученной структурой — по-прежнему остается во многом неясным. Было предложено три: различных механизма:

1. Роль нуклеофила выполняет ближайшая к разрываемой связи N-ацетиламиногруппа субстрата, а роль донора протонов—аспарагиновая кислота.

2. Тот же, что и выше, но действие N-ацетиламиногруппы дополнительно усиливается за счет выступающей в качестве акцептора протона ионизованной карбоксильной группы глутаминовой кислоты Glu-35.

3. Роль нуклеофила выполняет ионизованная карбоксильная

группа аспарагиновой кислоты Asp-52, а роль донора протонов— карбоксильная группа глутаминовой кислоты Glu-35.

Константа скорости катализируемого лизоцимом гидролиза /г-нитрофенил-2-ацетамидо-4-0- (2-ацетамидо-2-дезокси-{3-0глюкопиранозил)-2-дезоксиглюкопиранозида в 20 раз выше, чем в

случае /г-нитрофенил-4-О- (2-ацетамидо-2-дезокси-{3-о-глюкопиранозил)-{3-0-глюкопиранозида [16], что указывает на важную

роль ацетамидной группы.

Однако результаты кинетического исследования гидролиза небольших субстратов свидетельствуют о том, что более предпочтительным является согласованный механизм с участием донора и акцептора протона или комбинированный механизм с участием донора протона и нуклеофила. Было установлено, что лизоцим способен катализировать реакцию трансгликозилиро-вания. Это свойство фермента легло в основу способа синтеза гс-нитрофенил-^-с-глюкозида и соответствующего олигомера. Поскольку лизоцим катализирует гидролиз гликозидных связей, вблизи которых ацетил аминогруппы отсутствуют, можно заключить, что анхимерное содействие со стороны N-ацетиламиногруппы не является непременным элементом механизма ферментативного расщепления гликозидных связей. Границы активного центра лизоцима точно не определены, однако ясно, что его размеры должны быть велики, поскольку фермент способен взаимодействовать с гексасахаридами, и, кроме того, кинетика реакции сильно зависит от длины сахаридного субстрата. Это означает, что лизоцим должен отличаться склонностью к образованию непродуктивных комплексов (т. е. таких фермент-субстратных комплексов, которые не приводят к образованию продуктов реакции). Особенно убедительно выглядят данные, свидетельствующие об образовании оксокарбониевого иона и участии в катализе глутаминовой кислоты Glu-35. Сохранение конфигурации аномерного центра позволяет заключить, что если оксокар-бониевый ион возникает в ходе катализа, то его пространственное строение жестко фиксируется ферментом.

6.9. Ферментативный перенос протона: стереохимия

Применение в качестве субстратов изотопно-меченных карбокислот является удобным инструментом исследования стереохимии ферментативного переноса протона. В отличие от органических реакций в ферментативных реакциях стереоспецифический перенос протона является скорее правилом, чем исключением, что обусловлено асимметричной природой поверхности белковой молекулы. В качестве примера можно привести две реакции изотоп