пептидазы и в механизмах декарбоксилирования под действием металлозависимых ферментов и ферментов, действующих через основание Шиффа, является отражением различия в восприимчивости карбонилсодержащих соединений к кислотному и основному катализу. Нуклеофильные и основные свойства боковых цепей белковой молекулы вполне достаточны для проявления ферментом каталитической активности, тогда как ионы металлов являются гораздо более эффективными кислотными катализаторами по сравнению с протонами, о чем убедительно свидетельствует пример металлоферментов. Другая причина широкой распространенности металлоферментов связана, вероятно, с полидентатным характером комплексов металлов. Строго определенное пространственное расположение нескольких реагентов внутри одного и того же комплекса позволяет легко оптимизировать действие эффектов сближения и ориентации.

6.6. Ферментативный перенос протона: металлоферменты

Протекание большого числа ферментативных реакций невозможно в отсутствие ионов металлов, активно участвующих в каталитическом процессе. Природа ионов металлов, необходимых для проявления ферментативной активности, варьируется в широких пределах — от ионов щелочных металлов Na+ и К+ и двухзарядных ионов Са2+, Mg2+, Zn2+, Fe2+, Cu2+, Co124" и Ni2+ до редко встречающихся многозарядных ионов ванадия и молибдена. Ионы металлов могут выполнять чисто структурные функции, однако чаще они прочно связаны с активным центром, принимая непосредственное участие в каталитической реакции. В этом случае роль иона металла может сводиться к стереоспецифическому образованию комплекса с молекулой субстрата, например с ее фосфатной группой. При катализе окислительно-восстановительными ферментами ион металла выступает в качестве переносчика электронов, осуществляя обратимый переход между двумя состояниями окисления.

Однако чаще всего непосредственно участвующий в ферментативной реакции ион металла выполняет, как и в обычных органических реакциях, роль кислоты Льюиса, которая действует аналогично протону, но с большей эффективностью (т. е. является суперкислотой, см. гл. 9). В таких реакциях всегда наблюдается одновременный перенос протона между ферментом и субстратом, поэтому в некотором смысле их можно рассматривать как катализируемый ионами металла ферментативный перенос протона. В качестве примера рассмотрим механизм реакции, катализируемой карбоксипептидазой.

Карбоксипептидаза — это металлофермент, содержащий один атом цинка на молекулу белка. Карбоксипептидаза катализирует гидролиз С-концевой пептидной связи в белках и олигопеп-тидах и сложных эфиров а-оксикислот. Кинетический изотопный эффект растворителя равен 2 при гидролизе сложноэфир-ного субстрата О-(гранс-циннамоил)-ь-р-фениллактата и всего лишь 1,33±0,15 при гидролизе пептида N- (N-бензоилглицил)-L-фенилаланината [11]. По данным рентгеноструктурного анализа карбоксипептидаза представляет собой глобулярный белок, в котором содержится один атом цинка, координированный двумя остатками гистидина. Кроме того, в состав активного центра входят карбоксильная (Glu-270), фенольная (Туг-248) и гуанидиновая (Arg-145) группы. Последняя образует ионную связь со свободной карбоксильной группой субстрата. Простейший механизм, согласующийся со всеми имеющимися к настоящему времени структурными и кинетическими данными, представлен на рис. 6.5 [11, 12].

Реакция протекает через промежуточный ацилангидрид с одновременным отщеплением концевой карбоновой кислоты. На второй стадии происходит быстрая реакция ацилангидрида с водой. Возможно, что фенольная группа Туг-248 на стадии деаци-лирования действует как общее основание, отрывая протон от молекулы воды, а на первой стадии — даже как общая кислота, отдавая протон уходящей группе. Возможен также альтернатив(GLU-270) (ARG-145)

R2-CO 0-CHR,-C02Комплекс Михаилuca TL

) i t i

CRJ-O-CHR^CCV

C + (NH2)2 + HO CHR, CO,"

CRZ TI'H«°

E + RJC02~

Рис. 6.5. Механизм действия карбоксипептидазы [1].

ный механизм, в котором функцию общего основания выполняет остаток Glu-270 [13]. Точные экспериментальные доказательства того или другого механизма в настоящее время отсутствуют. Ясно, однако, что роль иона металла сводится к тому, что он, действуя как общая кислота, обеспечивает поляризацию карбонильной группы и одновременно вносит вклад в обеспечение жесткой ориентации пептидной или сложноэфирной связи, которая требуется для образования показанного на схеме тетраэдрического промежуточного соединения. Необходимость поляризации обусловлена тем, что атакующий карбоксилат-ион является слабым нуклеофилом. Ион металла, по-видимому, не принимает непосредственного участия в переносе протона и не взаимодействует с другими участвующими в реакции донорами или акцепторами протона.

Более подробно металлоферменты рассмотрены в гл. 9.

6.7. Ферментативный перенос протона:

рацемаза миндальной кислоты

Насколько можно судить по имеющимся к настоящему времени данным, катализ рацемазой миндальной кислоты осуществляется по простейшему ферментативному м